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红汁乳菇(Lactarius hatsudake)是一种美味的食药用真菌,具有独特的风味和丰富的营养物质,广泛分布在我国的湖南、安徽、福建、四川、湖北和广西等地。目前对红汁乳菇中萜类物质的研究仅停留在初步的分离纯化及结构解析上,对其生物活性尤其是抗炎活性的研究较少。因此,红汁乳菇中的萜类化合物具有巨大的研究价值和开发潜力。

大量研究表明多种食用菌具有抗炎的作用,主要是通过减少炎症介质的产生来达到抗炎的效果。中南林业科技大学食品科学与工程学院,林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室的张馨方、杨亚兰、任佳丽*等以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞为炎症模型来评估红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性,并初步探究红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响,旨在为红汁乳菇的精深加工提供科学依据。

1、红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的结构解析

对分离纯化所得的化合物进行结构分析,图1为紫外-可见波段扫描图谱,在244、289、376 nm有3个吸收峰,最大吸收波长在289 nm处,根据Woodward-Fieser经验规则,推测所得的化合物可能存在4个共轭双键。

由图2可知,在6.5 min处有一高强度峰,根据面积归一法初步推导其纯度为96.7%。

由图3可知,在正离子模式下,所得的化合物的分子离子峰为m/z 197.172 8。

1H NMR(图4)和13C NMR(图5)的解析结果为,1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):δ 8.36(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),δ 7.69(1H,dd,J=10.9 Hz,2.0 Hz,H-6),δ 7.64(1H,d,J=3.8 Hz,H-2),δ 7.30(1H,d,J=3.8 Hz,H-3),δ 7.07(1H,d,J=10.9 Hz,H-5),δ 5.37(1H,brs,H-13a),δ 5.20(1H,brs,H-13b),δ2.79(3H,s,H-14),δ 2.62(3H,s,H-15),δ 2.26(3H,brs,H-12);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz):δ 146.4(s,C-4),δ 145.1(s,C-11),δ 136.9(s,C-7),δ 136.5(d,C-8),δ 135.0(s,C-10),δ 134.0(d,C-6),δ 132.8(s,C-9),δ 131.7(d,C-5),δ 127.1(s,C-1),δ 124.5(d,C-2),δ 114.4(t,C-13),δ 113.8(d,C-3),δ 23.5(q,C-14),δ 22.9(q,C-12),δ 12.8(q,C-15)。图4和图5结果与文献[30]报道基本一致,故可以得出该化合物分子式为C15H16,结构式如图6所示,为愈创木烷型倍半萜化合物。

2、红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞形态和活性的影响

如图7所示,空白对照组和实验组的巨噬细胞形态均完整无缺。MTS法检测愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞活性的影响,如图8所示,空白对照组和实验组(25、50、100 μg/mL愈创木烷型倍半萜化合物)的吸光度分别为0.861±0.03、0.849±0.034、0.845±0.028、0.844±0.029,实验结果表明,空白对照组和实验组的吸光度没有显著差异(P>0.05),说明质量浓度为25、50、100 μg/mL的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物不会影响巨噬细胞的活性,因此选择这3个质量浓度进行后续实验。

3、红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子mRNA相对表达水平的影响

结果如图9所示。通过对比空白对照组、LPS模型组和实验组(25、50、100 μg/mL愈创木烷型倍半萜化合物)细胞炎症因子mRNA的相对表达水平可知:和空白对照相比,LPS模型组的IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA相对表达水平明显升高,说明LPS成功诱导巨噬细胞产生炎症反应,且这些细胞因子与LPS诱导的炎症反应密切相关;和LPS模型组相比,实验组中IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA表达水平均极显著下降(P<0.01),且随着愈创木烷型倍半萜化合物质量浓度不断升高,表达量均不断降低,呈现较好的浓度依赖性,说明该愈创木烷型倍半萜化合物能极显著降低由LPS诱导的RAW264.7细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相对表达水平(P<0.01)。

4、红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子蛋白相对表达水平影响

结果如图10所示。和空白对照组相比,模型组的COX-2、IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6的相对表达水平均明显升高,说明LPS成功诱导巨噬细胞产生炎症反应。与已经诱导产生炎症反应的模型组细胞相比,实验组的COX-2、TNF-α、iNOS的蛋白相对表达水平均随着该愈创木烷型倍半萜化合物质量浓度的升高而递减,对于IL-1β和IL-6,仅有高质量浓度的愈创木烷型倍半萜化合物(100 μg/mL)能够使其相对表达水平极显著降低(P<0.01)。实验结果说明一定质量浓度的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物能降低LPS刺激的巨噬细胞中炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的表达。

5、红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞中通路MAPK磷酸化的影响

结果如图11所示。与空白对照组相比,LPS可以刺激巨噬细胞中磷酸化-JNK(phospho-JNK,p-JNK)、磷酸化-p38(phospho-p38,p-p38)、磷酸化-p44/42(phospho-p44/42,p-p44/42)蛋白相对表达水平明显升高;与LPS模型组相比,不同质量浓度的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物对p-p38蛋白表达的抑制效果较小且较为相近,当质量浓度达到100 μg/mL时,样品会使p-JNK蛋白的表达明显降低,而经梯度质量浓度的该愈创木烷型倍半萜化合物处理后,巨噬细胞中p-p44/42蛋白相对表达水平逐渐下降。结果表明一定剂量的红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物处理能极显著降低p44/42、p38和JNK 3种蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.01),从而抑制MAPK炎症通路的活化。

结 论

本研究从新鲜红汁乳菇子实体中提取愈创木烷型倍半萜化合物,发现该化合物在0~100 μg/mL不会影响巨噬细胞的活性,采用LPS诱导RAW.264.7巨噬细胞模型,发现该化合物可以抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS的分泌与表达;同时,可以降低p44/42、p38和JNK 3种蛋白激酶的磷酸化水平,通过抑制MAPK通路的活性,下调炎症因子的表达,具有良好的抗炎活性。本研究对红汁乳菇精深加工产品的开发具有一定的指导意义。

本文《红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性》来源于《食品科学》2022年43卷13期48-54页,作者:张馨方,杨亚兰,张慧,罗非君,任佳丽。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220111-106。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑:袁艺;责任编辑:张睿梅

图片来源于文章原文及百度图片。

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